Сейчас на сайте

Базовые механизмы генной инженерии

Несколько предварительных замечаний

1. Ген представляет собой определенную последовательность нуклеотидов (комплекс из одного из четырех видов азотистых оснований, сахара дезоксирибозы и фосфатной группы), образующих цепочку ДНК. В этой последовательности нуклеотидов закодирован тот или иной белок. Впрочем, большая часть ДНК не содержит генов, т.е. является "молчащей".

2. Генетической рекомбинацией называют перестройки ДНК. Различают общую и сайт-специфическую рекомбинацию. При общей рекомбинации происходит генный обмен между двумя гомологичными нуклеотидными последовательностями ДНК, например, между гомологичными хромосомами в ходе кроссинговера. При сайт-специфической рекомбинации гомологии участков не требуется и в ходе этой рекомбинации происходит перераспределение нуклеотидных последовательностей в геноме. Именно этот вид рекомбинации позволяет выделять те или иные участки хромосомы, премещать их в пределах данной хромосомы, присоединять к другим хромосомам и даже к хромосомам других организмов.

3. Перемещение участков генома осуществляется часто так называемыми мобильными генетическими элементами, к числу которых принадлежат вирусы, плазмиды и транспозоны. Эти элементы могут присоединять те или иные гены к своей ДНК (или РНК в случае ретровирусов), а затем, оказавшись в клетке-хозяине, встраиваться вместе с "оторванным" чужеродным геном в хромосому хозяина, которая потом уже реплициуется вместе со всей этой новой последовательностью.

4. Вирусы представляют собой молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК), одетой, как правило, белковой оболочкой. Для размножения вирусам необходимы клетки других организмов, ферменты которых они используют для репликации своей ДНК. Обычно вирус после попадания в клетку пораженного им организма размножается в ней, после чего множество новых вирусных частиц разрушает клетку и поражает другие клетки. Иногда разрушения клетки не происходит, а ДНК вируса встраиватеся в ДНК клетки-хозяина.

5. Перемещение генов из одного организма в другой при помощи мобильных генетических элементов называется горизонтальным переносом. Искусственный горизонтальный перенос и лежит, чаще всего, в основе генной инженерии.

Далее излагается по книге "Молекулярная биология клетки". Б. Албертс, Д., Брей, Дж. Льюис и др. (Москва, Мир, 1994г.)

Для того, чтобы выделить тот или иной ген из цепочки ДНК, используют ферменты бактериальных клеток, которые разрезают двойную спираль в специфических локусах. Эти ферменты называются рестриктазами (рестрицирующими нуклеазами). Специфичность рестриктаз в отношении нуклеотидных последовательностей у разных видов бактерий различна, поэтому можно подобрать такую рестриктазу, которая вырежет небольшой фрагмент ДНК, содержащий определенный ген. По размеру этого участка и будут опредедять данный ген в дальнейшем при выделении его из смеси. Еще одно важное свойство рестриктаз - создание ступенчатых разрывов, при которых образуются на обоих концах ДНК-фрагмента одноцепочечные "хвосты" (липкие концы). Благодаря липким концам два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований.

Рис. 5-78 (Из книги "Молекулярная биология клетки")

Рис. 5-79 (Из книги "Молекулярная биология клетки")

Клоноироание того или иного гена начинается с создания библиотеки ДНК в вирусном или плазмидном векторе…

Плазмидные векторы, используемые при клонированиеии генов, представляют собой небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, происходящие от более крупных плазмид, обычно присутствующих в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих. Как правило, они составляют лишь небольшую фракцию всей ДНК клетки-хозяина, однако благодаря малым размерам их можно легко отделить от молекул хромосомной ДНК, которые, будучи более крупными, при центрифугировании оказываются на дне пробирки. Клонирование начинают с того, что очищенные кольцевые молекулы плазмидной ДНК обрабатывают одной из рестриказ и получают таким путем линейные молекулы ДНК. Затем клеточную ДНК, из которой требуется создать библиотеку, разрезают при помощи той же рестриктазы и полученные рестрикционные фрагменты (включая и те, в которых присутствует клонируемый ген) добавляют к разрезанным плазмидам, а затем подвергают отжигу, для того чтобы могли образоваться рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК. Ковалентное сшивание под действием ДНК-лигазы завершает образование этих рекомбинантных молекул, содержащих вставки чужеродной ДНК (см. рис. 5-78).

Следующий шаг к получению библиотеки ДНК состоит в том, что рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК вводят в клетки (обычно бактериальные или дрожжевые), сделав их для этой цели временно проницаемыми для ДНК; клетки, как принято говорить, трансфицируют плазмидами. Теперь, когда эти клетки растут и делятся, рекомбинантные плазмиды также реплицируются, в результате чего получается в конце концов огромное количество копий кольцевых молекул, содержащих чужеродную ДНК (рис. 5-79). Многие бактериальные плазмиды несут в себе гены устойчивости к антибиотикам. Это их свойство можно использовать для того, чтобы отделить трансфицированные клетки от тех, которые остались нетрансфицированными: если выращивать бактерии в присутствии антибиотика, то выживут и образуют колонии только те клетки, которые содержат плазмиды. Эти выжившие клетки и заключают в себе библиотеку ДНК. Однако лишь немногие из них несут те рекомбинантные плазмиды, в которых находится подлежащий выделению ген. Надо уметь их идентифицировать, чтобы получить интересующую нас ДНК в очищенном виде и в достаточном количестве…

Безусловно, описанными методами не исчерпываются приемы генной инжерии, однако, уже это дает представления о тех главных принципах, которые лежат в основе генноинженерных подходов.

Уважаемые читатели! Мы просим вас найти пару минут и оставить ваш отзыв о прочитанном материале или о веб-проекте в целом на специальной страничке в ЖЖ. Там же вы сможете поучаствовать в дискуссии с другими посетителями. Мы будем очень благодарны за вашу помощь в развитии портала!